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所属学科:畜牧兽医

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黑龙江省教育厅科学技术研究项目

申请书

(重点项目)

项目名称:麦蓝菜促泌乳活性成分定向培育技术及应用研究

项目负责人:袁肖寒

实验室名称:省高校农生物功能基因重点实验室

项目联系人:袁肖寒

联系:13936460424

联系地址:东北农业大学生命中心

邮政编码:150030

项目起止日期:2016.1-2016.12

申报学校(盖章):

填表日期:2016.6.20

黑龙江省教育厅制

项目承诺书

申请人承诺:

1,项目申请书中填报的各项内容真实准确,并经项目组所有成员一致确认,并愿意承担由于填报不实带来的后果.

2,如果项目获得批准立项,本申请书将自动成为项目合同,本人及项目组所有成员将遵守《黑龙江省教育厅科学技术研究项目管理办法》的有关规定,认真开展研究工作,取得预期研究成果.

申请人(签章):

年月日

一、简表

况项目名称麦蓝菜促泌乳活性成分定向培育技术及应用研究类别基础研究□应用基础研究√应用研究□起止时间2016.1-2016.12申请金额3万元重点实验室名称黑龙江省农业生物功能基因重点实验室研究方向泌乳生物学项

人姓名袁肖寒性别女出生年月1977.9职称助研最后学历研究生学位硕士所学专业生物学从事专业生物学年参加月数10项

组总人数高级中级初级博士生硕士生参加单位数77252主要

成员

(不

者)姓名性别年龄从事专业技术

职务单位学位本人签字李楠女28生物学讲师省农业技术职业学院硕士孙哲女31生物学实验师东北农业大学硕士佟慧丽女31生物学讲师东北农业大学博士刘莹女34生物学助研东北农业大学硕士曲波男34生物学助研东北农业大学博士

二,立项依据

项目的目的意义

我国奶牛业普遍存在产乳量低,奶牛发病率高等严重问题,产奶量低,乳脂和乳蛋白含量相对不高等问题是制约我国奶牛养殖业发展的主要因素,因而如何优质高效地提高奶牛产奶量,使其接近或达到世界先进水平已成为养殖业的首要问题.中药以其源自天然,毒副作用小,无残留,不易产生耐药性的优点,己广泛应用于我国奶牛业.麦蓝菜麦蓝菜(Vaccariasegetalis(Neck)Garcke)为石竹科一年生草本植物,广泛分布亚洲,欧洲.该植物种子在中药中称王不留行(Semenvaccariae),我国麦蓝菜资源丰富,主产于河北,山东,辽宁,黑龙江等地,以河北产量最大.

《本草纲目》在该药的"释名"中说:"此物性走而不住,虽有王命不能留其行,故名."别名:不留行,王不留行(《吴普本草》),禁宫花,剪(《日华子本草》),金剪刀草(《稗史》),金盏银台(《纲目》),麦蓝子(《甘泉县志》).原植物麦蓝菜(《救荒本草》)又名:道灌草,大麦牛,兔儿草,麦加菜,王牡牛.处方名:王不留行,王不留,炒王不留行,炒王不留,炒不留,留行子.商品名:王不留行,不留行,留行子.以子粒均匀,饱满,色乌黑,干燥,无杂质者为佳.药材在四,五月麦熟时采收(东北地区在秋季).割取全草,晒干,使果实自然开裂,然后打下种子,除去杂质,晒干.炮制方法:簸净杂质,置锅内,用文火炒至爆开白花六,七成时取出,放凉[4-5].

王不留行的主要功能为催乳.王不留行中含有多种成分,其中主要含有三萜皂苷,黄酮苷,环肽,类脂和脂肪酸,单糖等多种成分.除具有催乳功能外,王不留行还可以治疗痛经,闭经,乳痈肿痛,也可治疗小便不利,淋沥涩痛以及带状疱疹等.

2.2王不留行的化学成分

王不留行含多种皂甙,其中王不留行皂甙(Vacsegoside)经酸水解得王不留行次皂甙(Vaccaroside)及D一葡萄糖,L阿拉伯糖,D一木糖,L岩藻糖,L鼠李糖.王不留行次皂甙再经酸水解得棉根皂甙元(伪,sogenin)及B一D一葡萄糖醛酸.王不留行尚含王不留行黄酮甙(vaccarin),预试尚有生物碱及香豆素类化合物反应.桑圣民等已报道从王不留行的乙醇提取物中分离得到27个化合物[1-9],张荣平等从王不留行中分离并鉴定了4个环肽化合物[10],鲁静等从王不留行中分离鉴定了刺桐碱和异肥皂草苷[11].表1-1总结了目前已发现的王不留行中含有的化学成分.这为王不留行天然资源的开发利用及活性成分的药理学研究奠定了基础

2.3麦蓝菜药理作用

麦蓝菜种子在中药中称王不留行,由于王不留行能够激活血流量和促进乳汁分泌,通常作为妇女产后治疗各种疾病的药方.JiangsuME等(1986)研究已经表明,王不留行种子乙醇提物含有三萜皂甙,糖苷,用于治疗闭经和感染前期此外一些已分离的非甾体环肽segetalinA,B,G和H表现出雌激素样活性(2-4).Itokawa,H.etal.(1995).王不留行种子甲醇提取物,乙酸乙酯提取物中的环肽连续给药14天,大鼠子宫重量成剂量依赖性增加.桑圣民等(2000)报道王不留行环肽A和王不留行环肽B有较强的雌激素样活性,具有抗早孕,抗肿瘤,兴奋子宫,促进乳汁分泌等药理学作用.从王不留行中分离提取的三萜皂甙类成分segetosideB具有抑制黄体细胞的作用(Sang等,2002).沈尔安(2002)报道王不留行的化学成分含有多种皂甙,并有生物碱及香豆素类化合物,有镇痛,收缩子宫,抗凝血,散癖消肿,行血止炎的作用.秦君等(2016)分离获得了王不留行的主要几种成分,发现其黄酮甙类成分激活催乳素介导的泌乳信号,可以促进小鼠乳腺上皮细胞Stat5磷酸化水平和cyclinD1表达的增加,并且能促进β-酪蛋白表达的增加和促进小鼠泌乳量的升高.巴音吉日嘎拉等(2007)研究王不留行,穿山甲对未性成熟小鼠乳腺实质发育的影响,发现王不留行能提高卵巢样激素分泌的基础水平,使卵巢功能增强,促进发育,并证明了王不留行对内分泌调节的安全性和无毒性.苗培(2007)对大鼠采取王不留行提取液的灌胃试验,结果发现其能够促进大鼠泌乳量的增加,并可能通过刺激脑垂体增加催乳素的分泌进而促进大鼠乳腺增生.王不留行作为重要的催乳中药其催乳效应的应用研究与其催乳机理值得深入进行.

2.3.2王不留行的其他临床应用

王不留行除了在临床上具有活血通经及下乳的重要应用外,同时还具有其他许多效用.杨淑坤等(1997)用王不留行籽贴压耳穴法治疗面神经麻痹44例,总有效率为95.4%.此外,王不留行籽耳穴贴压法治疗失眠50例的总有效率为94%(杨淑娟等,2000).王不留行在耳穴压丸法治疗过敏性鼻炎47例的总有效率为93.6%(林红等,1999).王不留行在治疗突发性耳聋32例临床实验中的总有效率为75.0%(刘福官等,2000).

王不留行在治疗胆结石患者6~9个月后,胆结石超声象面积明显明显缩小.张仁〔1998〕

2.4植物促泌乳活性研究进展2007)研究结果表明,中剂量(10mg.kg-1)的葛根素无论对性未成熟雌性小白鼠体重,子宫及卵巢,血清中孕酮,生长激素,催乳素含量,还是乳腺发育均呈现出一定程度的植物雌激素样促进作用,另外葛根素对性未成熟雌性小白鼠体重,子宫及卵巢,乳腺等发育的影响和对血清中孕酮,雌二醇,生长激素,催乳素等含量影响基本相吻合.

植物环肽一般是指高等植物中主要由氨基酸肽键形成的环状类含氮化合物.目前发现的植物环肽主要由2至37个L-构型的编码或非编码氨基酸组成.它是一类重要的植物代谢产物,是先导化合物发现命中率较高的一类天然小分子.自1959年环肽cyclolinopeptideA被发现并确定结构以来,植物环肽研究已走过近半个世纪.而在20世纪90年代以前只发现了150多个环肽,主要集中在鼠李科环肽生物碱的新发现和抗肿瘤茜草科类型环肽研究上.

Morita.H.etal(1995)从王不留行种子中分得一个环六肽化合物(甘,缬,脯,缬,色,丙),命名为segetalinA,后又分得另三个环肽,分别命名为segetalinB,segetalinC,segetalinD.生物活性测定4周龄的SD种母鼠,切除卵巢,皮射2.5mg/kg的试样,给药2周,以雌三醇为对照,与末次剂量后取其子宫,称取重量(均以mg计)结果对照组子宫增重45.0±7.9.表明A和B有较明显的雌激素样活性而CD不明显.AB都有色丙甘缬顺序的氨基酸组合,可能即为雌激素活性的主要结构要求.

3,项目的应用前景,学术价值

我国奶牛业普遍存在产乳量低,奶牛发病率高等严重问题,产奶量低,乳脂和乳蛋白含量相对不高等问题是制约我国奶牛养殖业发展的主要因素,因而如何优质高效地提高奶牛产奶量,使其接近或达到世界先进水平已成为养殖业的首要问题.中药以其源自天然,毒副作用小,无残留,不易产生耐药性的优点,己广泛应用于我国奶牛业.中草药王不留行Semen Vaccariae)含王不留行苷,棉根皂苷元,多种单糖等成分,具有抗早孕,抗肿瘤,兴奋子宫,促进乳汁分泌等药理作用,湿润气候,能耐旱王不留行可能具有激素样活性,可激活信号途径,调控乳蛋白,乳糖和乳脂等生物物质的合成而促进泌乳.雌激素对雌性哺乳动物生殖发育及泌乳能力的影响已经成为近年来的研究热点之一因而从筛选的王不留行增乳功能活性组分研究其催乳机理具有重要的价值.

4,现有研究工作基础,现有条件和手段

研究工作基础:

本课题组从事研究

现有条件:

本实验室有很强的硬件和软件条件PCR仪,荧光定量PCR仪,生物安全柜,纯水仪,核酸蛋白分析仪,分子杂交炉高压液相色谱仪,冷冻干燥仪,冷冻高速离心机等所需的大型仪器设备

三、研究方案

1,主要研究内容,创新点,目标或经济技术指标

研究内容

(1)麦蓝菜不同生长发育时期促泌乳生物活性成分在麦蓝菜根,茎,叶,种子的分布及动态变化规律研究.环境因子(光照,土水分,营养等)对麦蓝菜中促泌乳生物活性成分代谢调控作用,分析调控提高各活性成分含量最优的生态环境因子.麦蓝菜粗提液催乳活性

采用有机溶剂浸提法提取麦蓝菜中总黄酮,其提取率受有机溶剂种类及体积分数,提取温度,提取时间,液固比等因素影响,分别进行单因素试验.得出最佳单因素条件后用Minitab14软件设计响应面试验,对结果进行响应面回归和方差分析,对提取条件进行优化.用数学计算软件Mathematica求出最佳提取条件

(3)奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立

采用组织块培养法,联合应用差酶消化法和反复贴壁法建立体外奶牛乳腺上皮胞培养体系,采用透射电镜,等试验技术方法对乳腺上皮细胞性进行检测.

麦蓝菜粗提液对奶牛乳腺上皮细胞促增殖作用

研究麦蓝菜粗提液对奶牛乳腺上皮细胞体外生长的促增殖效应.确定麦蓝菜黄酮类物质为备筛药物,采用奶牛乳腺上皮细胞为试验材料,在细胞培养液中添加不同浓度的麦蓝菜粗提液,采用MTI比色法,比较其对细胞增殖的促进作用.

麦蓝菜粗提液促进奶牛乳腺上皮细胞增殖调控机理的初步研究

试验以奶牛乳腺上皮细胞为试验模型,采用流式细胞仪检测王不留行对乳腺上皮细胞增殖周期分布,cyclinD1,p27蛋白在乳腺上皮细胞内阳性表达的影响.

麦蓝菜粗提液对奶牛乳腺上皮细胞体外分泌性能的影响

以奶牛乳腺上皮细胞为试验模型,研究王不留行作用前后细胞内部超微结构的变化,细胞裂解液中总浓度及组分的变化规律,以及细胞裂解液中蛋白总浓度的变化.

麦蓝菜粗提液对奶牛乳腺上皮细胞合成乳铁蛋白和酪蛋白的影响

以奶牛乳腺上皮细胞为试验模型,应用荧光定量PCR技术研究王不留行对乳腺细胞β酪蛋白和乳铁蛋白基因表达的影响应用法检测,王不留行作用前后乳腺细胞裂解液中β酪蛋白和乳铁蛋白含量的变化.2kg+每产3kg奶增加1kg精料补充料),全株玉米青贮20kg,羊草5kg,青玉米秸秆15kg.实验奶牛的饲养管理按黑龙江省奶牛营养标准制定的饲养程序进行.根据兽用中药剂量,中药注射液按有效单体进行投料制备成0.15mg/ml进行试验.选健康的泌乳期荷斯坦奶牛6只,随机取3只,分别作为注射组与对照组,连续测定其3d的泌乳量,第3d起对奶牛进行催乳成分的中药注射,连续进行5d,记录奶牛泌乳量的变化以观察催乳效应.全日观察奶牛的日常情况,采食量,采用机器榨奶,日榨乳2次,每头奶牛全天所产奶混匀后取50ml进行乳成分分析.

创新点

(1)首次确定促进关键泌乳活性成分含量增量的最佳环境因子组合

(2)首次测定麦蓝菜活性成分在根,茎,叶各器官中含量时空动态分布

(3)首次建立了麦蓝菜泌乳活性成分响应面测定方法

研究目标

(1)建立促进关键泌乳活性成分含量增量的最佳环境因子组合

(2)找到麦蓝菜活性成分在根,茎,叶各器官中含量时空动态分布

(3)建立麦蓝菜泌乳活性成分响应面测定方法

()论文-2篇

2,技术关键点和难点

(1)麦蓝菜促泌乳活性成分分离提取

(2)麦蓝菜对奶牛乳腺细胞泌乳机理的研究

3,主要研究方法和技术路线

研究方法

1麦蓝菜环境因子试验

光照的控制

按正交设计表,通过覆盖遮荫网控制其相对光照强度,使各组的平均光照强度控制在设计范围之内,每隔天采集样品,每次采集样品株,0cm×30cm,50cm×25cm,50cm×20cm,50cm×15cm,50cm×10cm,50cm×5cm五个水平,每隔天采集样品,2麦蓝菜催乳活性部位的分离提取及含量测定

1)标准曲线的绘制

准确称取干燥恒质量的芦丁标准品10mg,加适量甲醇溶解并定容至100mL,摇匀备用.准确吸取标准品溶液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0与6.0mL分别置于25mL容量瓶中,加水至6mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%氢氧化钠溶液10mL,加水至刻度,摇匀,放置15min,在510nm波长处测定吸收度.以吸光度A为纵坐标,芦丁浓度C为横坐标,绘制标准曲线.

2)样品总黄酮量的测定

准确吸取样品溶液1mL置于25mL容量瓶中,以未加样品的溶液作空白,按上述方法测定黄酮质量分数,带入回归方程,求得样液中总黄酮的量.

3麦蓝菜腺上皮细胞的作用

1)乳腺上皮细胞的原代,传代培养及纯化

中部消毒,按照常规手术切取少量乳腺组织块,立即用D-Hanks液清洗组织块并尽量剥离脂肪组织和结缔组织,取乳腺腺泡组织部分剪成1mm3的小块,以0.5cm的间距接种于预铺胶原蛋白的细胞培养瓶中,铺满整瓶后,倒置培养于37℃的CO2培养箱中约3~4h,至组织块牢固贴于胶原上时,轻轻将生长培养液加入培养中,以覆盖组织块为准,随后置于培养箱中继续培养,每隔2d更换一次培养液,至细胞生长密度达80%~90%时,利用乳腺上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶敏感性的不同对细胞进行传代培养以获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞.


2)麦蓝菜活性成分对奶牛乳腺上皮细胞促增殖作用,麦蓝菜活性成分促进奶牛乳腺上皮细胞增殖调控机理的初步研究,麦蓝菜活性成分对奶牛乳腺上皮细胞体外分泌性能的影响,麦蓝菜活性成分对奶牛乳腺上皮细胞合成乳铁蛋白和酪蛋白的影响.

4,项目的进度安排

2016.5-2016.12

麦蓝菜不同生长发育时期促泌乳生物活性成分在麦蓝菜根,茎,叶,种子的分布及动态变化规律研究.环境因子对麦蓝菜中促泌乳生物活性成分代谢调控作用,分析调控提高各活性成分含量最优的生态环境因子.

2016.1-2016.7

麦蓝菜促泌乳活性成分黄酮苷提取分离及含量测定

2016.8-2016.12

奶牛乳腺上皮细胞的原代,传代培养及纯化

2016.1-2016.6

麦蓝菜中促泌乳生物活性成分细胞增殖细胞裂解液中基酸进行必要的补充实验,分析各项实验结果,形成发表科技论文.

四,经费预算

申请资助金额(万元)按年度2016年201年201年0.2用于购买1.8用于实验试剂,耗材的购买,水,电等费用4,资料,印刷费0.2用于实验资料查询等费用6,旅差,会议费7,出版,鉴定,验收费0.65用于课题结题,发表文章版面费,申请专利等费用0.15用于学校科研经费管理费用(万元)

五、项目组主要成员研究成果

1,5年内发表过的相关论文,专着,专利等(限10项)

题目刊物名称姓名,第几完成人时间中药王不留行对奶牛乳腺细胞增殖及泌乳的影响中国畜牧兽医2016王不留行增乳活性单体对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能的影响乳业科学与技术王不留行增乳单体对牛乳产量和乳品质的影响中国乳品工业中药王不留行增乳活性单体及催乳素对奶牛乳腺上皮细胞特异性miRNA的影响中国畜牧兽医InfluenceonCellularSignalTransductionPathwayinDairyCowMammaryGlandEpithelialCellsbyGalactopoieticCompoundIsolatedfromVaccariaesegetalisAgriculturalSciencesinChina佟慧丽22016.4芳香型直投式酸奶发酵剂实用新型专利DL200520022038.5袁肖寒52006.6芳香型直投式酸奶发酵剂包装

结构实用新型专利ZL200520022038.5袁肖寒42007.7转基因大豆,玉米和水稻外源基

因检测通用标准分子实用新型专利袁肖寒52016.11粮食作物深加工制品高通量五

重巢式PCR转基因检测方法发明专利201610137461.8袁肖寒52016.112,正在进行或5年内已完成的相关科研项目情况(限5项)

项目名称姓名,第几承担人立项时间东北农业大学创新团队项目奶牛乳腺物质转化与能量代谢规律及泌乳功能调控技术袁肖寒52007年袁肖寒102007年袁肖寒22016年22016年

主要粮食作物深加工产品转基因检测试剂盒的研制袁肖寒42016年 六,审批意见

重点实验室意见

(公章)

实验室主任(签章)年月日

学校审查意见

(公章)

主管部门负责人(签章)年月日

省教育厅审批意见

(公章)

审批人年月日

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