本站原创摘 要土壤农杆菌介导的基因转移是目前最常用的获得转基因植物的方法,农杆菌的Ti质粒包括了复制原点、vir基因、冠瘿碱代谢基因和T－DNA区域.在土壤农杆菌的T－DNA的转移过程中起关键作用的物质和结构是：乙酰丁香酮、T－DNA的右边界、vir基因的诱导表达.
关 键 词土壤农杆茵 T－DNAvir基因 基因工程 克隆载体 乙酰丁香酮
中图分类号Q－49 文献标识码E
土壤农杆菌是一种植物病原菌,属根瘤菌科,为革兰氏阴性菌,它通过根部伤口侵入植物体,刺激植物在被侵入部位形成冠瘿瘤,引发根癌病.患病植株生长缓慢,严重时植株死亡.冠瘿瘤的形成是由于土壤农杆菌的Ti质粒上的一段DNA,转入植物细胞后,整合进植物的染色体上,进而干扰被侵染植物的正常生长,这段DNA被称为T－DNA.这种具有天然转基因功能的质粒,被改造后,可以用作基因转移的载体,实现目的基因导入到植物细胞中.
1 土壤农杆菌的Ti质粒
土壤农杆菌的质粒大小为200－250kb,包含有四个区域：复制原点、vir基因、冠瘿碱代谢基因和T－DNA区域,如图1所示.
1.1 T－DNA区域
T－DNA区域包含有一个生长素基因、细胞分裂素基因和冠瘿碱合成基因；这些基因都只有在T－DNA插入植物基因组后才能激活表达,其中生长素基因和细胞分裂素基因可以催化生长素和细胞分裂素的合成,调节植物细胞的生长和分裂,它们的过度表达会引起被侵染部位的植物组织过度生长,形成冠瘿瘤.冠瘿碱合成基因的表达可以在植物冠瘿瘤内催化冠瘿碱合成,冠瘿碱可以为土壤农杆菌的生长繁殖提供碳源和氮源.
T－DNA的两端分别有左边界和右边界的序列,右边界的序列包含一个25kb的重复序列,右边界的完整能保证T－DNA区域中任何基因都能完整地整合到植物基因组中,缺失实验表明,左边界的序列不参与整合过程.
1.2 vir基因
vir基因位于T－DNA以外的一个35kb的区域内,已发现有编码基因22－24个,这些基因都编码与T－DNA转移有关的蛋白质；vir基因的表达受植物酚类物质的诱导,其中乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮的诱导作用最强.vir区存在8个操纵子,分别为virA～VirH,一股情况下,除virA和virG外,其他vir基因都处于关闭状态.
1.3 冠瘿碱代谢基因
冠瘿碱代谢基因的表达能使土壤农杆菌利用冠瘿碱作为碳源和氮源.有证据表明,大部分的其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱作为碳源.因此,土壤农杆菌以其独特的方式来操纵植物细胞,使之成为仅为自己使用的含碳化合物的生产基地.
1.4 复制原点
与Ti质粒的自我复制有关.
2 土壤农杆菌T－DNA转移的分子机制
农杆菌T－DNA的转移过程大致分为以下几个步骤.
2.1 趋化与附着
受伤的植物组织分泌一些酚类、糖类、氨基酸类等趋化性物质吸引农杆菌向受伤部位集中,其中乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮是非常重要的诱导物.
2.2 viI基因的诱导表达
在Ti质粒的vir区,除virA和virG基因以外,其他基因在没有诱导物存在的情况下都处于关闭状态；virA基因表达的是农杆菌细胞膜上的一种跨膜蛋白(vir蛋白),而virG基因表达的是胞质蛋白；当virA蛋白接受诱导物(乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮)的作用后,发生磷酸化,使virA蛋白被诱导活化,活化后的virA蛋白又将磷酸基团转移给胞质中的virG蛋白,使virG蛋白被活化；活化的VirG蛋白,通过结合到每个Vir基因上游12bp序列的Vir盒上,来诱导Vir区各基因的表达.Vir基因表达的蛋白质对T－DNA的剪切、转移和整合有重要作用,其中的virD蛋白与T－DNA的剪切有关,virB蛋白定位在细胞膜上,是T－DNA的转移通道.
2.3 T－DNA的剪切和转运
在virDl和virD2蛋白的作用下,以质粒的T－DNA为模板,合成一条单链的T－DNA,单链T－DNA在其5’端结合上virD2蛋白,形成T链复合体；该复合体在VirD4蛋白的协助下,通过virB蛋白形成的跨膜通道,进入植物细胞；而VirE2蛋白则在VirEl蛋白的协助下,通过同一运输通道运出,两者在植物细胞质中结合成复合物.
2.4 T－DNA在植物细胞内的整合与表达
T链复合体在进入植物细胞质后,virD2蛋白可以引导复合体运向核孔,并在virD2和VirE2的共同作用下穿过核孔进入植物细胞核内,某些寄主植物的蛋白质也参与了此过程,T－DNA整合进植物染色体的机制还不太清楚,但整合的部位是随机的.整合后的T－DNA在植物细胞内表达生长素和细胞分裂素,干扰植物的生长,同时还表达冠瘿碱的合成,为农杆菌提供碳源和氮源.整个转移过程如图2所示.
3 Ti质粒衍生的载体系统
利用Ti质粒对植物进行遗传转化,可以将目的基因插入T－DNA区,然后通过土壤农杆菌和Ti质粒将目的基因送入受体植物；Ti质粒虽然是一种非常有效的天然载体,但是把它作为常规的克隆载体却有以下几个缺陷：
(1)转化细胞在生长过程中会产生植物激素,从而破坏受体植物的激素平衡.因此要将T－DNA区的生长素基因和细胞分裂素基因从克隆载体中删除.
(2)参与冠瘿碱合成和代谢的基因对转基因植物没有作用,还会因为将能量转化为冠瘿碱而降低植物的产量,因而也要删除.
(3)Ti质粒过于庞大,不利于重组操作,所以要除掉一切不必要的大片段DNA.
(4)Ti质粒在大肠杆菌中不能复制,Ti质粒中插入外源DNA后,要在大肠杆菌中克隆重组质粒,还要加上大肠杆菌质粒的复制原点,否则无法在大肠杆菌中复制和保存.
鉴于以上几点,人们构建出了很多Ti质粒衍生的克隆转化载体,所有Ti质粒衍生的克隆转化载体都有以下相似的结构组成：
(1)选择标记基因.多为新霉素磷酸转移酶,能使转化植物细胞获得卡那霉素抗性.由于该标记基因来源于原核生物,要让其在植物细胞内表达,还要加上真核生物的转录调控序列.
(2)DNA复制原点.它使质粒能在大肠杆菌中进行复制,某些载体还带有可在农杆菌中复制的复制原点.
(3)T－DNA右边界序列.它对于T－DNA的整合是必不可少的.目前使用的多数克隆载体都同时含有左边界和右边界序列.
(4)多个限制酶切点.为方便克隆基因,在T－DNA的左右边界序列之间,还包含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点.
(5)vir基因.vir基因对于T－DNA整合进植物细胞是必须的,现在一般有两种方法解决vir基因的问题：
①利用双元载体系统.双元载体系统中的克隆载体既有大肠杆菌的复制原点,也有农杆菌的复制原点,但载体上不带有vir基因.转化农杆菌之前,所有的克隆操作步骤都在大肠杆菌中进行；在完成克隆以后,将其转入一种含有修饰过的Ti质粒的土壤农杆菌中,该Ti质粒含有一整套的vir基因,但缺乏T－DNA序列,只起到提供vir蛋白的作用,因而它只是一种辅助质粒,能够帮助克隆载体进入植物细胞.
②共整合载体系统.共整合载体系统由一个缺失了T－DNA的Ti质粒和一个普通穿梭克隆载体组成.其中克隆载体和经修饰的Ti质粒中都含有一段同源的DN段.当带有外源基因的克隆载体进入土壤农杆菌后,通过同源重组就可以把克隆的基因整合到修饰过的T－DNA上,然后由Ti质粒提供T－DNA向植物细胞转移所必需的vir基因产物.
目前农杆菌转化法是植物基因工程中最常使用的转化方法,研究表明,利用农杆菌转化的外源基因基本能够稳定遗传,转基因后代表现符合盂德尔规律；外源基因整合位置比较稳定；整合的外源基因基本上能保持结构的完整性,很少发生重排；整合的外源基因多数是单拷贝,在转基因植物中表达率较高,共抑制现象较少.另外,农杆菌法不需要太多的设备,转化成本较低,也促进了农杆菌法在植物基因工程中的普及应用.长期以来,用土壤农杆菌介导的基因转移都局限在双子叶植物的范围内,随着对T－DNA转移机制的进一步了解,发 现植物分泌的乙酰丁香酮和vir基因的表达水平是转化成功的关键因素.现在,用土壤农杆菌转化单子叶植物也取得了成功,许多实验证明,土壤农杆菌能够将T－DNA转入玉米细胞中,并在其中稳定表达.